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技術文章

PCR實驗的下一步驟是什么?

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PCR(聚合酶鏈式反應)實驗包含多個步驟,完成一輪常規 PCR 反應后,接下來常見的步驟及后續操作有以下這些情況:


一、產物檢測

1、瓊脂糖凝膠電泳檢測:

制備合適濃度(通常根據產物大小等因素選擇,比如檢測幾百 bp 的片段可能用 1% - 1.5% 瓊脂糖凝膠)的瓊脂糖凝膠,將 PCR 產物與適量的上樣緩沖液混合后,加入到凝膠的加樣孔中,同時加入合適的 DNA 分子量標準(如 DNA Marker)作為對照,在電泳緩沖液中進行電泳,之后通過凝膠成像系統觀察是否有預期大小的條帶出現,以此判斷 PCR 擴增是否成功以及產物特異性等情況。

2、熒光定量 PCR 檢測(如果是實時熒光定量 PCR 實驗):

通過相應的熒光定量 PCR 儀器自帶的分析軟件,分析擴增曲線、熔解曲線等數據,來確定目標基因的起始拷貝數、判斷擴增的特異性等,比如觀察熔解曲線是否為單一峰,單一峰往往意味著擴增產物特異性良好,如果出現雜峰可能提示有非特異性擴增等情況。


二、產物純化(若后續有需要)

1、柱式純化:

利用硅膠膜柱在特定緩沖液條件下對 DNA 有吸附作用,而雜質等可以被洗脫去除的原理,先將 PCR 產物加到柱子上,經過結合、洗滌等步驟,最后用低鹽緩沖液或純水將吸附在柱子上的 DNA 洗脫下來,得到純化后的 PCR 產物,可用于后續的克隆、測序等操作。

2、磁珠純化:

基于磁珠表面修飾的基團能與 DNA 特異性結合,在磁場作用下方便進行分離操作,通過一系列結合、清洗、洗脫步驟,去除雜質和多余的引物、dNTP 等,獲取純化的 PCR 產物。


三、克隆測序(針對需要進一步分析基因序列等情況)

1、連接反應:

將純化后的 PCR 產物與合適的克隆載體(如常見的 pUC 系列載體等)在 DNA 連接酶的作用下進行連接,使 PCR 產物插入到載體中構建重組 DNA 分子,一般要在合適的連接體系(包含載體、插入片段、連接酶、緩沖液等)、適宜的溫度(如 16℃左右過夜連接等)條件下進行操作。

2、轉化:

把連接產物導入到感受態細胞(如大腸桿菌感受態細胞)中,通過熱激法(將細胞和連接產物混合后冰浴、短暫熱激、再冰浴等步驟)或電轉化法(利用電穿孔技術使細胞攝取外源 DNA)等方式,使細胞獲得重組質粒,然后將轉化后的細胞涂布在含有相應抗生素的固體培養基平板上培養,篩選出含有重組質粒的陽性克隆。

3、挑取克隆及測序:

從平板上挑取單克隆菌落,培養后提取質粒,送往專業的測序公司或者利用實驗室自己的測序儀器進行測序,以獲得準確的 PCR 產物的堿基序列信息,便于后續的序列比對、變異分析等工作。


四、后續功能驗證(在基因表達調控等相關研究中)

1、構建表達載體(如果是針對基因功能研究):

將 PCR 擴增得到的目的基因片段插入到合適的表達載體(比如真核表達載體 pcDNA 系列等用于在真核細胞中表達目的基因)中,然后通過轉染等方式(如脂質體轉染、電轉染等)將表達載體導入到相應的細胞系中,使細胞表達目的基因產物,后續可以通過檢測蛋白表達水平(如 Western blot 等方法)、細胞表型變化等,來研究該基因的功能特性。


具體下一步驟要根據 PCR 實驗的最初目的、后續的應用需求等來確定。

TEL:18016231680

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